寨卡病*核酸检测试剂注册审查指导原则征

寨卡病*核酸检测试剂注册审查指导原则

（征求意见稿）

本指导原则旨在指导注册申请人对寨卡病*核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门提供参考。

本指导原则是对寨卡病*核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用。若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供体外诊断试剂注册申请人和技术审评人员使用的指导性文件，但不包括审评审批所涉及的行*事项，亦不作为法规强制执行，应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

寨卡病*属于*病*科*病*属，呈球形，直径约为40-70nm，有包膜。基因组为单股正链RNA，长度约为10.8Kb，两端为非编码区，内部的单一开放读码框依次编码3种结构蛋白，包括衣壳蛋白（C）、膜蛋白前体/膜蛋白（prM/M）、包膜蛋白（E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5），根据基因组序列不同分为亚洲型和非洲型两个基因型。

寨卡病*病的检测方法包括病*核酸检测、病*抗原检测、IgM和IgG抗体检测、中和抗体检测和病*分离培养等。寨卡病*与*病*属其他病*具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病*核酸检测。核酸检测主要采用逆转录实时荧光PCR、恒温扩增等方法，检测样本类型包括血清、血浆、尿液、精液或唾液等。

本指导原则适用于采用逆转录实时荧光PCR法，对血清、血浆、尿液、精液或唾液等样本中的寨卡病*核酸进行体外定性检测的试剂。

对于采用其他方法学的寨卡病*核酸检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述内容不够全面，申请人应参照本指导原则，根据产品特性对适用部分进行评价，并补充其他的评价资料。

本指导原则适用于寨卡病*核酸检测试剂注册申请和变更注册申请的情形。本指导原则针对寨卡病*核酸检测试剂注册申报资料中的部分内容进行撰写，其他未尽事宜应当符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等相关法规要求。

二、注册审查要点

（一）监管信息

1.产品名称及分类编码

产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》及相关法规的要求，如寨卡病*核酸检测试剂盒（荧光PCR法）。根据《体外诊断试剂分类规则》，该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为。

2.其他信息还包括产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录以及符合性声明等文件。

（二）综述资料

综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。应详细说明产品所采用的技术原理及检测流程。提供不同适用机型的检测通量，即一次检测最多可检测的样本数。提供核酸提取（手工和自动提取方式应分别明确）和PCR扩增的时间，以及检测全过程所需的时间。不同检测流程，分别提供最少和最多检测样本量下的检测时间。与已上市同类产品进行比较，比较内容包括样本类型，检测原理，检测靶基因，组成成分，内标，质控品，判读规则，分析性能和临床性能等。

预期用途中明确产品检测的靶基因，需选择保守性和特异性相对较高的基因，同时还应考虑基因的扩增效率。检测基因的选择应提供相关指南或文献，并分析所检测基因的灵敏度和特异性是否符合临床需求。

（三）非临床资料

1.产品技术要求及检验报告

注册申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据产品研制、前期评价等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献资料，结合产品特性按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求编写。该类产品作为第三类体外诊断试剂，应当以附录形式明确主要原材料以及生产工艺要求。

如有适用国家标准品、行业标准，产品技术要求的相关要求应不低于相应的要求。

2.分析性能研究

注册申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细资料。

如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。

适用的不同样本类型应分别进行分析性能研究。

分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。研究中采用的寨卡病*阳性样本，应采用科学合理的方法确定其阴阳性和浓度水平，提交具体的试验资料。建议采用国际标准品建立校准曲线的方法确定研究样本的浓度。分析性能评估用样本一般应为真实样本，如涉及稀释后检测，应采用与适用样本类型一致的阴性基质。不可采用质粒、假病*或体外转录RNA等，进行分析性能评估。对于各项性能中采用的样本，在下述各项性能研究资料中分别提供样本信息列表。检出限和包容性研究中所用样本应相互独立。

2.1样本稳定性

考虑到病*RNA极易被降解的特性，应对样本稳定性进行详细研究，包括采集后未经处理的样本，灭活处理后的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。

建议对每种样本类型均进行稳定性研究。

如核酸提取液可不立即进行检测，还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。

2.2适用的样本类型

列表列明产品适用的样本类型。

对于血清和血浆样本类型，可选择有统计学意义数量的样本进行样本一致性的同源比对研究。研究样本应包含阴性、高值阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性等不同性质和浓度水平。

如产品适用于其他样本类型，应对其他所有样本类型进行全性能评估。

2.3企业参考品验证

根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。

2.4精密度

应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。

采用临床样本或病*培养物进行精密度评价，应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：

阴性样本：不含待测物，阴性检出率应为%（n≥20）。

临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应≥95%（n≥20）。

中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5包容性

2.5.1采用生物信息学方法对产品检测的包容性进行研究，研究应覆盖已公布的寨卡病*核酸序列。

2.5.2验证具有时间和区域特征性的不同来源的阳性样本，应包括检出限和重复性的验证。样本应覆盖已知寨卡病*的主要型别，包含对亚洲型、非洲型和其他重点型别各不少于3个不同来源的阳性样本（临床样本或病*培养物）的研究。

2.6检出限

2.6.1检出限的确定

建议采用亚洲型和非洲型的流行株样本系列稀释于与适用样本一致的基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度重复检测，记录不同浓度检出的结果，采用适当的模型（如Probit分析）和分析方法，将具有95%阳性检出率的 浓度水平作为确定的检出限。申请人可采用半数组织感染量测定法（TCID50）的方法进行*株浓度确认，以TCID50/mL作为*株浓度的表示方式；也可采用空斑形成单位（PFU）的方式进行*株浓度的确认，以PFU/mL作为*株浓度的表示方式。除此之外，申请人还应采用数字PCR、标准曲线等方法进行*株核酸浓度的确认，以copies/mL作为*株浓度的表示方式。

2.6.2检出限的验证

选择另外3例不同来源的寨卡病*样本在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。

2.7分析特异性

2.7.1交叉反应

需验证相关病原体和多例人类基因组DNA（表1）的交叉反应。建议在病*和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的浓度水平为CFU/mL或更高，病*为PFU/mL或更高，提供所有用于交叉反应验证的病原体样本的来源、阴阳性、种属/型别和浓度确认等试验资料。

对于某些难以培养或因为生物安全性无法培养的病原体，可采用病原体核酸样本进行交叉验证。应提供用于交叉反应验证的病原体核酸的来源、组成和浓度等信息，浓度可采用copies/mL单位表示。

表1需进行交叉反应验证的物质

注：*标注为可采用生物信息学分析的方法进行研究的病原体。

2.7.2竞争性干扰

申请人应充分考虑临床上容易与寨卡病*合并感染的病原体，如登革病*等，在高浓度的情况下对低浓度（例如检出限浓度）寨卡病*核酸检测的影响，进行竞争性干扰研究。

2.7.3干扰试验

应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在 浓度（“最差条件”）条件下进行试验，检测包含临界阳性水平在内的寨卡病*样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的Ct值差异。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质及在样本采集和处理期间引入的物质。

表2用于干扰试验的物质

2.8核酸（RNA）提取/纯化性能

在进行核酸检测之前，建议有核酸（RNA）提取/纯化步骤。该步骤的目的除 量分离出目的RNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，并与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。

2.9反应体系

2.9.1样本采集和处理

2.9.1.1样本采集方式的选择

2.9.1.2样本采集时间点的选择：是否受病程、临床症状、用药情况等因素的影响。

2.9.1.3样本处理方式的选择：研究产品适用的灭活方式，包括热灭活和化学灭活，化学灭活部分应对常见的消*剂的适用性进行研究。研究样本前处理方式，包括对不同样本类型的离心条件的确定研究等。

2.9.2核酸提取和反应体系

研究确定 核酸提取和反应体系，包括核酸提取用的样本体积、洗脱体积和PCR加样体积、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。建议在保证核酸提取质量的情况下尽量扩大总反应体系和加样量，以提高检测灵敏度。

提交不同适用机型基线和阈值循环数的确定资料。

不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。

3.稳定性研究

申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性、运输稳定性、机载稳定性（如适用）及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括具体的实施方案、详细的研究数据以及统计分析结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。对于开瓶稳定性研究应模拟真实使用情形，包括开瓶稳定性的开瓶频次和开瓶时间等。

4.阳性判断值研究

阳性判断值一般为申报产品检测病*核酸阳性的Ct值。阳性判断值研究用样本来源应具有多样性和代表性，考虑不同时间、地域、不同的感染阶段和生理状态等因素，尽量纳入较多弱阳性和高阴性水平的样本。在条件允许的情况下，建议覆盖目前的流行株进行阳性判断值研究。如判定值存在灰区，应提供灰区的确认资料。

如果产品适用不同样本类型，需要对各样本类型进行阳性判断值的验证。

提交阳性判断值研究所用样本的背景信息列表，至少包括性别、年龄、临床诊断信息、样本来源机构、检测结果等信息。

提供内标检测结果范围的确定方法和研究资料。

5.其他资料

5.1主要原材料研究资料

该类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、质控品、参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量控制标准等相关研究资料、质控品的定值试验资料等。如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应提供资料包括：选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检验报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。供应商应固定，不得随意更换。

5.1.1引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、靶序列的基因位点及两者的对应情况。建议每种病*设计两套或多套引物、探针以供筛选，通过序列比对和功能性试验等方式，对病*进行包容性和特异性（如交叉反应）的评价，其中序列比对包括与已公布寨卡病*序列的比对，及与易产生交叉反应的其他病原体的序列比对；功能性试验包括对不同来源、不同滴度的寨卡病*核酸阳性样本，和不同的近缘病原体的检测。通过筛选确定 的引物和探针组合。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性试验等。

5.1.2脱氧三 核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，应提供对其纯度、浓度、功能性等的详细验证资料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，应分别对酶活性、功能性等进行评价和验证。

5.1.4质控品

试剂盒一般包含阴性质控品和阳性质控品。阳性质控品应包含试剂盒检测的靶序列，可采用假病*制备。质控品需参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程，以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。提交试剂盒质控品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料，对质控品的检测结果Ct值范围做出明确的要求。

5.1.5内标

内标，又称内对照，可对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增。申请人需对内标的引物、探针设计和相关反应体系的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。明确内标的检测结果Ct值范围。建议科学设置内标，对待测样本的取样质量、试剂的反应体系进行监控。

5.1.6企业参考品

该类产品的企业参考品一般包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品和重复性参考品。应根据产品性能验证的实际需要设置企业参考品。

应提交企业参考品的原料来源、选择、制备、阴阳性及浓度确认方法或试剂等相关验证资料。企业参考品应采用临床样本，或者使用病*培养物加入阴性基质。企业参考品的设置建议如下：

阳性参考品：应着重考虑不同来源的病*样本和滴度要求，应至少选取不同来源的5个病*样本。

阴性参考品：主要涉及对交叉反应的验证情况，建议包括登革病*（DENV-1～DENV-4）、西尼罗病*、*热病*、乙型脑炎病*、森林脑炎病*、基孔肯雅病*、新型布尼亚病*、汉坦病*、汉城病*、麻疹病*、风疹病*、丙型肝炎病*、EB病*、人巨细胞病*、肠道病*71型、柯萨奇病*A16型、埃可病*、细小病*B19；立克次体、钩端螺旋体、疟原虫；伤寒杆菌、金*色葡萄球菌等。

检出限参考品：可采用95%阳性检出水平或略高于检出限的水平，如%阳性检出水平。

重复性参考品：建议包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为检出限附近的浓度。

5.2生产工艺研究资料

介绍产品主要生产工艺，可用流程图结合文字的方式表述。提交主要生产工艺的确定及优化研究资料。

（四）临床评价资料

该类试剂应通过临床试验路径进行临床评价。临床试验应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》《医疗器械临床试验质量管理规范》和《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求，如相关法规、文件有更新，临床试验应符合更新后的要求。下面仅说明该类产品临床试验中应